大气压等离子体射流对PLLA纤维膜表面改性方法(3)
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组织工程是研究开发用于修复人体组织或受损器官的一门新兴学科。理想的组织工程支架应具有适当的力学性能、良好的生物相容性以及生物可降解性,以便为细胞粘附和增殖提供物理支撑和空间,促进细胞构建特定的功能组织或器官,并可在体内被降解吸收[1]。左旋聚乳酸(PLLA)是一种有着良好力学性能的医用级生物可降解性材料,已在血管组织工程、骨组织工程等生物医学领域得到了广泛的应用[2]。和传统薄膜结构的PLLA相比,三维多孔结构的PLLA纤维膜,由于可以模拟细胞外基质的结构和功能,非常有利于营养物质的传递,因此近年来得到越来越广泛的重视和关注。然而,PLLA纤维膜由于较低的表面能和化学惰性,致使其表现出疏水性和较差的细胞亲和力[3-4],因此,通过改善PLLA膜的表面特性来增强其与生物环境的相互作用就显得尤为重要。常见的表面改性方法有湿化学处理、紫外线照射、臭氧处理和低温等离子体处理[5]。与其他方法相比,低温等离子体处理是一种环境友好型方法,改性层很薄,不会影响材料的固有性质,且改性不受材料尺寸和形貌的影响[6]。然而,常用的低气压等离子体处理需要复杂昂贵的真空系统, 并且处理对象的尺寸受到真空室尺寸的限制[7]。近些年来,新发展起来的大气压低温等离子体射流(APPJ),因其中含有高浓度的活性粒子,可在常压和开放环境中工作,并且结构简单、成本低、操作灵活,因而在材料表面改性和生物医学等领域得到越来越多的关注[8]。目前,利用APPJ对多孔纤维结构的PLLA进行表面改性的研究还少有报道,因此有必要深入研究并发展一种低成本、简单快捷的PLLA纤维膜表面改性方法,以提高其亲水性和生物相容性。本文通过静电纺丝技术制备了PLLA纤维膜,然后利用APPJ对PLLA纤维膜进行表面改性。试验结果表明,APPJ中含有高浓度的活性官能团,经其处理后的PLLA纤维膜亲水性大大提高。小鼠成肌细胞的培养试验表明,在经过APPJ改性过的PLLA纤维膜表面,细胞的增殖性能和生长形貌要明显优于未处理的纤维膜,纤维膜的生物相容性和细胞亲和力大大提高。本文的研究成果在组织工程和生物医学工程中具有重要的应用前景。1 试验方法1.1 PLLA纤维膜的制备静电纺丝装置示意图如图1所示。为了制备PLLA纤维膜,称取0.5 g左旋聚乳酸粒(PLLA)置于玻璃瓶中,然后加入4 mL二氯甲烷(DCM)和1 mL二甲基甲酰胺(DMF)制备成浓度为10%的左旋聚乳酸溶液,将混合好的溶液磁力搅拌4 h使其完全溶解。采用静电纺丝方法将PLLA溶液从注射器喷出,并在旋转滚筒上收集得到纤维膜,操作参数为:纺丝距离2 cm,施加正电压5 kV,负电压-2 kV,滚筒的转速是3 000 r/min,纺丝时间3 h。最后,将制备好的纤维膜放入干燥箱中,干燥至恒重,备用。图1静电纺丝装置示意图1.2 大气压等离子体射流表面改性APPJ装置示意图如图2所示。APPJ装置由玻璃管、聚四氟乙烯(PTFE)绝缘管、针状高压电极和环状接地电极组成。玻璃管长度为90 mm,内外径分别是3和5 mm。高压电极是直径为2 mm、长度为80 mm的铜棒,固定在玻璃管内。接地电极安装在距离玻璃管边缘30 mm处。该针环电极结构放电强烈,可产生大量等离子体活性粒子。图2大气压等离子体射流装置示意图1.3 C2C12细胞培养将小鼠成肌细胞C2C12培养在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和89%的DMEM溶液(总称培养液)中,并将其放在CO2浓度为5%、温度为37 ℃的培养箱中生长[9] C2C12细胞生长形貌的研究将C2C12细胞以密度为5×106/mL接种在PLLA纤维膜上,在培养1天后,使用磷酸盐缓冲液溶液(PBS)洗涤2次,并通过4%多聚甲醛溶液固定细胞。接下来,使用20%、30%、50%、70%、90%和100%梯度乙醇脱水2次,每次15 min,最后采用CO2临界干燥法干燥后,在扫描电子显微镜(SEM)下观察细胞形态[10] 数据统计所有试验数据以平均值±方差的形式呈现。2 结果分析2.1 PLLA纤维膜的形貌表征静电纺丝是通过施加静电力来控制纤维生产的纤维形成过程。在扫描电子显微镜下,纤维膜表面呈现出连续且无珠的纤维结构(见图3)。通过调节纺丝时间为3 h,将纤维膜的厚度控制在(100±12) μm。图4显示了PLLA纤维膜的纤维直径分布情况,通过Origin(Origin Lab,USA)分析PLLA支架纤维的平均直径为(1 184±182) nm。图3PLLA纤维膜表面形貌的SEM图片(500×)图4纤维直径分布情况2.2 大气压等离子体射流的发射光谱特性图5显示了在200~900 nm波长范围内,O2/He混合比为0.6%的情况下测得的APPJ发射光谱。图5中,工作电压?kV,工作距离为1 cm,氦气流速为1 000 sccm,氧气流速为6 sccm。研究发现,在大气压He/O2混合气体放电中,发射光谱包括氦原子和氧原子的谱线、N2+第一负带谱线、N2第二正带谱线[11],以及羟基(-OH)和NO粒子的谱线。杂质氮谱线的产生是等离子体射流与环境空气发生相互作用的结果。除此之外,由于环境空气和工作气体中都混合了少量的氧气和水蒸气,等离子体中的高能电子会通过非弹性碰撞激发、电离水蒸气和氧气等中性分子,进而产生羟基(-OH)和NO等活性粒子,这些活性粒子是对材料进行表面改性的主要成分。图5大气压He/O2等离子体射流发射光谱图2.3 PLLA纤维膜的亲水性能表征PLLA纤维膜表面的亲水性能可以用水接触角(WCA)来表征。图6所示为PLLA纤维膜表面的WCA随等离子体处理时间的变化情况,其中,工作电压?kV,工作距离为1 cm,氦气流速为1 000 sccm,氧气流速为6 sccm。从图6中可看出,未处理的PLLA纤维膜的WCA是120°,表现为超疏水性;在经过APPJ处理后,材料表面的WCA显著下降,表明材料的亲水性能得到很大改善。当施加电压?kV,O2/He混合比是0.6%时,观察到材料表面的WCA在经过4 min等离子体处理后急剧下降(从120°到29°)。由于He/O2APPJ环境富含活性氧粒子,经过APPJ处理后,在PLLA纤维膜表面引入了含氧极性基团,如羟基(-OH)和羧基(-COOH)[12],从而使得PLLA材料表面的亲水性能得到大幅度提升。从图6中观察得到,当处理时间从4 min增加至16 min时,材料表面的水接触角可缓慢下降至18°。综合考虑时间成本和获得的效益,将后续研究的处理时间优化至4 min。图6PLLA纤维膜表面水接触角随处理时间的变化情况2.4 XPS分析PLLA纤维膜表面化学元素的组成可通过X射线光电子能谱(XPS)来分析评估。图7显示了未处理和经过等离子体处理的PLLA纤维膜的XPS扫描全谱。等离子体处理参数:工作电?kV,工作距离1.0 cm,He流速1 000 sccm,O2/He混合比0.6%,处理时间4 min。从图7中可以看出,2种XPS全谱都具有2个分离的峰,其对应于C1s(285 ev)和O1s(532 ev),在等离子体处理后的PLLA纤维膜上还可以看到一个N1s峰(400 ev),表明等离子体射流与周围空气相互作用产生了活性氮粒子。此外,经过等离子体处理后,PLLA纤维膜上C1s归一化强度下降,相应地O1s归一化强度上升,即在等离子体改性后,O1s粒子所占比例上升。这是因为等离子体射流中的电子、离子和光子等物质与PLLA纤维膜表面相互作用后,使得纤维膜表面的C键断裂[13],并引入含氧官能团所导致的。这些亲水性的官能团能促使PLLA表面的WCA下降,这与图6的结果是一致的。a)未处理的PLLA纤维膜b)经过等离子体处理的PLLA纤维膜图7PLLA纤维膜的XPS扫描全谱2.5 C2C12细胞生长形貌研究图8显示了C2C12细胞在未处理和APPJ处理后的PLLA纤维膜上培养1天时的SEM图片。等离子体处理参数:工作电?kV,工作距离1.0 cm,He流速1 000 sccm,O2/He混合比0.6%,处理时间4 min。从图8中可以看出,和未处理的纤维膜相比,在APPJ改性过的纤维膜上,细胞拉长,呈现出C2C12细胞的特征纤维形态;并且,细胞在APPJ改性后的纤维膜上生长密度大大提高,而且形态上也更加铺展,说明APPJ表面改性大大提高了PLLA纤维膜的生物相容性和细胞亲和力,极大地促进了细胞的粘附、增殖和生长。图8C2C12细胞在未处理和APPJ处理后的PLLA纤维膜上培养1天时的SEM图3 结语本文首先通过静电纺丝法制备了PLLA纤维膜,然后提出使用针环电极结构的大气压He/O2等离子体射流装置对PLLA纤维膜进行表面改性。研究结果表明,He/O2大气压等离子体射流处理可以在PLLA纤维膜表面有效地引入羟基(-OH)和羧基(-COOH)官能团,大幅改善材料表面的亲水性能;小鼠成肌细胞C2C12在改性后的PLLA纤维膜上能更好地粘附、增殖和生长,表明APPJ表面改性能大大提高PLLA纤维膜的生物相容性和细胞亲和力。本文的研究成果在组织工程、生物医学工程等领域具有重要的应用前景。参考文献[1] 郭永伟. 多孔丝素蛋白材料及其在生物医学领域研究新进展[J]. 科技信息, 2013(4): 1-2.[2] Deng X, Sui G, Zhao M L, et al. 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文章来源:《生物医学工程学杂志》 网址: http://www.swyxgcxzzzz.cn/qikandaodu/2020/1210/399.html
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